ダブシル標識用

モレキュラービーコンプローブ¹は、ターゲットとなる配列とハイブリダイズするまで、溶液中で自然に発生する蛍光を抑制し続けます。 このため、モレキュラービーコンの設計では、配列の一方に蛍光部分、他方に蛍光抑制部分を持ち、この各分子は炭素鎖スペーサーによってオリゴヌクレオチドから離れた状態になるようデザインします。 Dabcyl基は、全般的な蛍光抑制(クエンチャー)作用を持っている事かわかっています。3’-Dabsyl CPG及び3’-Dabcyl CPG、5’-Dabcylホスホアミダイドは、3’末端において蛍光抑制を示すプローブを合成する際に使用し、5’-Dabcylホスホアミダイドは、5’末端に、蛍光抑制基(クエンチャー)を導入するのに使用し、Dabcyl-dTは配列内に追加されるので、3’末端でのポリメラーゼによる伸長を可能にします。

ビオチン標識用

PCビオチンは、光感受性の切り出しが可能な、5’-ビオチンホスホアミダイドです。 ビオチンTEG CPGは、3’末端にビオチンを持つオリゴヌクレオチドを直接合成できるよう、デザインされています。

デスチオビオチンは、ストレプトアビジンのようなビオチン結合性タンパク質に対して、比較的弱い結合性を示す、ビオチン類縁体です。 このビオチン類縁体は、分子中の硫黄基が欠けているため、、ビオチン/ストレプトアビジンの解離定数(Kd)よりも、格段に低い解離定数を示します。その結果、デスチオビオチンを持つ分子は、ビオチンを含む緩衝液中で、ストレプトアビジンから解離するようになります。 弊社は、このデスチオビオチンTEGホスホアミダイドとこれに対応するCPGを販売しております。

特別に御要望がない限りABI用ボトルとカラムを標準品として御提供致します。

フルオレセイン標識用

5’-フルオレセインホスホアミダイドには、4,4’ジメチトキシトリチル(DMT)基が含まれておらず、合成終了時に5’末端に1度だけ追加されます。 この製品は、6-カルボキシフルオレセイン誘導体を使用して調製されています。 テトラクロロ-およびヘキサクロロ-フルオレセインホスホアミダイドは、最新のDNAシークエンサーや遺伝子分析機の複数色検知機能で利用できるよう、デザインされています。 フルオレセインホスホアミダイドは、従来のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を使用して調製されたものと同様のフルオレセイン構造を形成するよう設計されています。 弊社のフルオレセインホスホアミダイドは、DMT基を持っており、カップリングの定量化が可能です。 類似構造の6-FAMを使用した6-フルオレセインホスホアミダイドも御用意しております。 フルオレセイン-dTは、オリゴ配列内のdTと入れ換えて導入する事が出来ます。

弊社では、4つのフルオレセイン・サポートを御用意しております。 フルオレセインCPGは、従来より3’末端にフルオレセイン標識を導入する際に使われてきました。 類似構造を持つ6-FAMを使用した3’-(6-フルオレセイン)CPGも、お求め頂けます。 更に、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)の誘導体である3’-(6-FAM)CPGとフルオレセイン-dT CPGもあります。 これら2つの製品は、両方とも単一異性体で、切り出しや脱保護の条件下でも安定で、異性体の生成が起こらないアミドリンクを使用しております。 3’-(6-FAM)CPGは、3’末端におけるポリメラーゼの伸長反応やエクソヌクレアーゼの消化作用を効率良くブロックする事が出来ます。 フルオレセイン-dT CPGは、これらの酵素活性が両方とも進むことを可能にします。 水酸化アンモニウムを使用した通常の切り出しおよび脱保護処理を行うと、簡単にフルオレセイン標識オリゴが遊離してきます。

これらの発色標識のスペクトルに関する特徴については、商品外装または添付の書類を御参照下さい。

ローダミン標識用

ローダミン誘導体は、通常の脱保護条件下では安定性を保つ事ができないため、必ずアミノ修飾オリゴを使って合成後に修飾する必要があります。 TAMRAは、塩基性下で安定ではないため、この修飾オリゴに対する切り出しと脱保護の処理方法には、細心の注意が必要となります。　ウルトラマイルド・モノマーと炭酸カリウムのメタノール溶液による脱保護法を使う事で、TAMRAオリゴヌクレオチドが比較的容易に遊離してきます。 　TAMRA修飾オリゴの合理的な合成のために、弊社では、3’修飾用の3’-TAMRA CPGと配列内への修飾用にTAMRA-dTを御用意しております。 更に、アミノ修飾されたオリゴヌクレオチドの修飾用として、TAMRA NHSエステルも販売しております。

シアニン標識用

二つのシアニン誘導体Cy3™とCy5™は、構造上、ポリエンリンクの炭素数が異なっており、これらと密接に関連する類似体、Cy3.5™ とCy5.5™が新しく弊社製品群に加わりました。　また、ホスホアミダイドとしても取り揃えております。 Cyダイは、通常、5&rspuo;末端に1度だけ追加され、MMT基は合成機で取り除かれます。 MMTカチオンの吸収波長(イエロー)は、DMTカチオン(オレンジ)と比べて顕著に異なるため、吸光測定式トリチルモニターでは、カップリング効率を正確に測定できない場合がありますが、伝導率測定機による遊離物検知法の方がより正確に検出されます。。 Cyダイは、導入後の合成工程中に0.02Mヨード酸化剤を使用すれば、3’末端に導入することが可能です。

Cyダイを含むオリゴの脱保護は、モノマーに使用されている塩基の保護基が何であるかにかかわらず、室温下で水酸化アンモニウム処理すると行う事ができます。 もし、室温以上の条件下で水酸化アンモニウムを使用しなければならない時は、Cy3とCy 3.5は、Cy5又はCy5.5よりもより良い安定性を示しますが、55°Cにて2時間以下に制限を可能にする等のように、塩基性で不安定な保護基持つモノマーにも対応できるよう配慮しなければなりません。 。

エポック社製ダイ及びクエンチャー(抑制剤)製品

グレンリサーチは、エポックバイオサイエンス社(Epoch Biosciences,Inc.)の合意を得て、エポック社の新技術に対応したDNAプローブの合成に使用する様々な製品を販売しております。 弊社は、エポック社のレドモンド・レッド、ヤキマ・イエロー、ギグ・ハーバーグリーン蛍光色素及びエクリプス(Eclipse)非蛍光性クエンチャー製品をご提供しています。 弊社では更に、修飾ヌクレオシドであるPPG及び5’-アルデヒド修飾C2ホスホアミダイド等の試薬もこの合意を受けて販売しております。 2つの蛍光染色製品である、ヤキマ・イエローとレドモンド・レッドは、ホスホアミダイドとサポートとして販売しております。 ヤキマ・イエローは、吸収極大が530nmおよび発光極大が549nmであるのに対し、レドモンド・レッドの吸収発光極大は、それぞれ579nmと595nmです。 ギグハーバー・グリーン及び6-FAMは、両方ともフルオレセインを基礎にした分子構造を持っていますが、ギグハーバー・グリーンの方がFAMよりも15-20%明るくなっています。

このエポック社のエクリプス・クエンチャーは、モレキュラービーコンやFRETプローブの合成において従来から問題とされていた点を解決できる優れた製品です。 エクリプス分子は非常に安定で、通常利用されているほとんどの脱保護環境下で使用することができます。　 エクリプス・クエンチャーの吸収極大は522nmで、ダブシルは479nmです。 また、エクリプス・クエンチャーの構造中には、ダブシルより多くの電子欠損が存在し、これにより、特に長い波長の発光極大を持つ、レドモンド・レッドやCy5など(赤色偏移)の多様な色素において効果的に蛍光抑制を示します。 更に、このエクリプス・クエンチャーは、390nmから625nmまで吸収範囲なので、広範囲の発色性FRETプローブに有効です。

ブラックホールクエンチャー・ダイ

赤色又は近赤外線ダイが広く一般に使用されてきているのを受けて、弊社では、ブラックホールクエンチャー・ダイ™(BHQ)をご提供する事となりました。 以下の表1にその物理的特徴を記載しましたが、BHQダイは、弊社の製品と合わせてお使い頂ければ、更に高い効果が期待できる高性能なダーク・クエンチャーです。 この製品は、水酸化アンモニウムの脱保護に対応しており、高いカップリング効率を示しています。また、非常に大きな吸光係数を持っており、全く蛍光を発生しません。　これらの吸収範囲は、広くCy3やCy5などの赤色範囲までに及んでおり、汎用されている様々な蛍光試薬に対応しています。　モレキュラービーコンにおいて最も良く使用されているダーク・クエンチャーにはダブシルがあります。 この抑制作用には、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、ほとんど関与していません。　マラス、クレーマー、タヤギによる文献¹に、22の蛍光物質に対するBHQ-1とBHQ-2が示す抑制作用の評価について詳細に紹介されています。　フルオレセイン等の短波長の蛍光物質では、抑制効果は、ほとんどダブシルと変わりませんが(91% – 93%)、Cy5等の遠赤色における蛍光波長を持つダイに対しては、BHQダイは、ダブシルで84%であったが96%と言う優れた抑制効果を示します。 これは、BHQが、FRETプローブ内においてもとても安定な非蛍光性複合体を作成する事に起因しています。 最近の研究で、モレキュラービーコンで使用されるヘアピン構造の場合においても、このような非蛍光性複合体が形成される事が示唆されています。²

アクリジン標識用

アクリジンホスホアミダイドは、オリゴヌクレオチドを合成する際に、分子内のどの位置でもアクリジンを付加することができます。　アクリジンCPGは、3’末端を標識する時に使います。　アクリジンはそれ自体で、インターカレート剤として作用します。

DNP標識用

2‚4-ジニトロフェニル(DNP)標識オリゴヌクレオチドを抗DNP抗体と一緒に使用してDNPを検出する分析試験が提唱されました。DNPホスホアミダイドを製品化する際に、弊社では分岐トリエチレングリコール(TEG)スペーサーを使用しているため、3’又は5’末端へ一度又は何度でも追加することを可能にしました。

コレステロール標識用

オリゴヌクレオチドの治療用試薬としての可能性を現実の物にするには、まず、適切な作用を発揮するため細胞膜を透過しなければなりません。オリゴヌクレオチドに脂溶性の置換基を追加する事によってこのような作用を可能にできると考えられます。　このようなコレステロール標識オリゴとその改良化合物の有効性は、すでに解明されています。　弊社では、複数標識に対応し、アセトニトリルに最大の溶解性を示す分岐トリエチレングリコール(TEG)スペーサーを介したコレステリル・ホスホアミダイドをご提供しております。

弊社では、特にご希望のない場合、ABI用ボトルとカラムを標準品としてご提供しています。

ソラレン標識用

5’末端にソラレンC2を修飾したオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2重ラセン構造形成用のクロスリンク試薬として作用します。　ソラレンC6には、原子6個分の長さを持つスペーサー鎖が接続しており、特にオリゴヌクレオチドの3重ラセン構造形成に使用されます。

EDTA標識用

EDTA-C2-dT ホスホアミダイドには、1本鎖又は2重ラセンDNAやRNAの配列特異的切断を誘発するEDTAトリエチルエステルが含まれております。 　この切断作用は、酸化鉄(II)によって一度だけ開始され、ジチオスレイトールを加える事でこの反応を直ちに抑える事ができます。 EDTA-dTのカップリングは、通常の方法で可能ですが、切出しと脱保護は、水性メタノール中で水酸化ナトリウム(0.4M水酸化ナトリウムのメタノール/水[4:1]混合溶液)を使い、室温で一晩反応させて行います。

ピューロマイシンCPG

スクリーニング・アッセイによって選択されたオリゴヌクレオチドやペプチドの配列情報を再現する事は、様々な化学を組み合わせて行う中で非常に困難な作業の一つです。 転移RNAの類似物質で、抗生物質でもあるピューロマイシンで3’末端を標識した合成RNAを、試験管内で翻訳する事により、mRNAとポリペプチドとの融合物がコードする物質を産生する方法¹が開発されています。　ピューロマイシンは、リボソームのA部位に結合し、ペプチド鎖の伸展部分に結合して、それ以上ペプチドが連結するのを阻害します。　ピューロマイシンをmRNAと結合する事によって、ペプチド-RNA融合物中のmRNAが翻訳されて産生するペプチドと、元のペプチドが繋がった状態の生成物が得られます。