末端修飾用

グレンリサーチの5’-修飾試薬は、DNA合成機で使用できるようにデザインされており、目的オリゴヌクレオチドの5’末端に特定の機能を持たせることが可能です。　この5’アミノ基修飾試薬は、用途に合わせてアームの鎖長を選べるよう多彩にご用意しています。　ジスルフィド チオール修飾試薬は、3’-又は5’-末端にチオールリンクを導入する時などに使用します。　ジチオールホスホアミダイド(DTPA)はジスルフィドを含む修飾試薬で、DNA又はRNA合成において、複数のチオール基を配列内のどんな位置にでも組み込むことができます。　1つのDTPA付加につき、それぞれ2つのチオール基となります。　この修飾試薬は、オリゴヌクレオチドと金表面との最適な結合ができるように設計されていますが、マレイミドや他のチオール特有の誘導体などを利用した多重反応にも使用できます。　5’-カルボキシ修飾C10は、オリゴ合成の最終末端に付加するようデザインされた特殊なリンカーです。この試薬は、カルボン酸を活性化したN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを形成しており、合成カラム上で1級アミンを持つ分子と迅速に反応し、安定したアミド結合を生成します。　光解離(PC)アミノ基修飾試薬は光によって切出しができるC6アミノ修飾で、弊社の光解離(PC)修飾用試薬製品の一つです。

配列内修飾用

配列内修飾用は、自動合成機で使用可能な試薬です。　カルボキシdTは、脱保護処理中に加水分解され、通常のペプチド・カップリング法によって、またはN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを中間体として、1級アミンを持つ分子へ直接結合させる事ができます。　アミノ修飾dA、アミノ修飾dC、アミノ修飾dG及び２つのアミノ修飾dTは、順にdA、dC、dG、dT残基の代わりとして、オリゴヌクレオチド合成時にそれぞれ配列内へ付加することができます。アミノ修飾サポートも、それぞれ対応するデオキシヌクレオシドサポートと交換可能です。　脱保護後は、C6類縁体の1級アミンは、オリゴヌクレオチドからスペーサーアームとして合計7-10原子分の距離があり、標識や酵素との結合に利用できます。C2類縁体は、オリゴヌクレオチドと共に反応するようデザインされた分子の付加に最も効果的にご利用になれます。

商品	商品番号	内容	価格($US)
アミノ修飾C6 dA	10-1089-90	100 µmol	205.00
	10-1089-02	0.25g	455.00
	10-1089-05	0.5g	910.00
アミノ修飾C6 dC	10-1019-90	100 µmol	225.00
	10-1019-02	0.25g	450.00
	10-1019-05	0.5g	900.00
アミノ修飾C6 dG	10-1099-95	50 µmol	240.00
	10-1099-90	100 µmol	480.00
	10-1099-02	0.25g	1100.00
カルボキシ-dT	10-1035-90	100 µmol	180.00
	10-1035-02	0.25g	360.00
	10-1035-05	0.5g	720.00
アミノ修飾C2 dT	10-1037-90	100 µmol	180.00
	10-1037-02	0.25g	360.00
	10-1037-05	0.5g	720.00
アミノ修飾C6 dT	10-1039-90	100 µmol	180.00
	10-1039-02	0.25g	360.00
	10-1039-05	0.5g	720.00

3’-末端修飾用試薬

3’-アミノ修飾CPGは、塩基性で不安定なFmoc基で保護されたアミノ基を持ち、目的オリゴヌクレオチドの3’-末端に1級アミンを導入できるように設計されています。　他の手法では、3’-アミノ基に変換するための窒素原子はフタルイミド(PT)基に含まれ、その芳香環に付加したアミド基を介してサポートに結合しています。　水酸化アンモニウムによる処理方法を長時間に変更すると(55°Cで17時間)、オリゴヌクレオチドの脱保護と同時にフタルイミドからアミンを遊離させる事ができます。　特にご希望のない限り、ABI用カラムを通常の商品として標準的にご提供しております。

3’-チオール修飾試薬は、オリゴヌクレオチドの3’-チオール導入に使用されています。　オリゴヌクレオチドの3’-末端にグリセリルCPGがある場合、過ヨウ素酸ナトリウムによって簡単に酸化され、3’-リン酸グリクアルデヒドが形成されます。　このアルデヒドは、更に酸化されると、相応するカルボン酸になります。　アルデヒドもカルボン酸塩もアミンを含む産物と複合する事ができます。　3’-アミノ修飾C6-dC-CPG又は3’-アミノ修飾C6-dT-CPGは、順に3’-末端のdC又はTと交換する事ができます。　これらの製品は、3’側へ簡単に標識することが可能で、末端の酵素活性を阻害しません。

商品	商品番号	内容	価格($US)
3'-チオール修飾C3 S-S CPG	20-2933-01	0.1g	85.00
	20-2933-10	1.0g	600.00
1 µmolカラム	20-2933-41	4個包装	125.00
0.2 µmolカラム	20-2933-42	4個包装	75.00
10 µmolカラム(ABI)	20-2933-13	1個包装	225.00
15 µmolカラム(Expedite)	20-2933-14	1個包装	350.00
3'-Glyceryl CPG	20-2902-01	0.1g	85.00
	20-2902-10	1.0g	600.00
1 µmolカラム	20-2902-41	4個包装	125.00
0.2 µmolカラム	20-2902-42	4個包装	75.00
10 µmolカラム(ABI)	20-2902-13	1個包装	225.00
15 µmolカラム(Expedite)	20-2902-14	1個包装	350.00
3'-アミノ修飾C6 dC CPG	20-2019-01	0.1g	120.00
	20-2019-10	1.0g	995.00
1 µmolカラム	20-2019-41	4個包装	200.00
0.2 µmolカラム	20-2019-42	4個包装	120.00
10 µmolカラム(ABI)	20-2019-13	1個包装	300.00
15 µmolカラム(Expedite)	20-2019-14	1個包装	450.00
3'-アミノ修飾C6 dT CPG	20-2039-01	0.1g	96.00
	20-2039-10	1.0g	800.00
1 µmolカラム	20-2039-41	4個包装	160.00
0.2 µmolカラム	20-2039-42	4個包装	96.00
10 µmolカラム(ABI)	20-2039-13	1個包装	240.00
15 µmolカラム(Expedite)	20-2039-14	1個包装	360.00

化学的リン酸化反応

化学的リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの5’-末端をリン酸化するのに最もよく利用されています。　この製品は3’-末端のリン酸化にも使用できますが、’-リン酸化CPGを使用すれば、リン酸基をオリゴヌクレオチドの3’-末端へ直接導入できます。　化学的リン酸化試薬IIは、その側鎖にあるDMT基は、塩基性条件下での後処理も安定を保ちオリゴヌクレオチドに接合したままとなるので、逆相精製法に使用する事ができます。　　このDMT基は酸性水溶液中で切り離され、その後、残りの側鎖は水酸化アンモニウムで簡潔に処理すると5’-リン酸が得られます。¹　特にご希望がない限り、ABI用ボトルとカラムを通常の製品として標準的にご提供しております。

アルデヒド修飾用

アルデヒド修飾は、求電子置換反応を起す傾向があり、アミノ基と反応してシッフ塩基を形成し、ヒドラジノ基と反応してヒドラゾンを形成、セミカルバジド化合物と反応してセミカルバゾンを形成する事ができます。　シッフ塩基はとても不安定なため、リンクの安定化のためにホウ化水素ナトリウムを加える必要がありますが、ヒドラゾンとセミカルバジドはとても安定です。　弊社では、エポックバイオサイエンス社からのご協力により、5'-アルデヒド修飾用C2ホスホアミダイドを販売しております。　アセタール保護基は、逆相HPLCやカートリッジ精製に適切な疎水性を持っており、オリゴの合成後、通常オリゴヌクレオチドの脱トリチル処理条件である80% 酢酸/20% H2O混合液か又は2%トリフロロ酢酸水溶液で、カートリッジ精製中に簡単に切り離す事ができます。

スペーサー修飾用

スペーサーホスホアミダイド C3、9、C12および18は、スペーサー鎖をオリゴヌクレオチドへ挿入するのに使用します。　長鎖スペーサーが必要な場合、これらの化合物によって複合的に付加する事ができます。　3’-スペーサーC3 CPGは、エクソヌクレアーゼやポリメラーゼの反応から3’-末端を保護する事もできます。　dスペーサーは、オリゴヌクレオチドへ安定した脱塩基部位を挿入するのに使われています。　PC スペーサーは、光解離性を持つC3 スペーサー修飾試薬で、弊社の光切断(PC)修飾用製品の一つです。

デンドリマー

デンドリマーは、個別的に高度に分枝した単分散ポリマーで、その形状は樹木の枝分かれに似ています。　単一または混合型のオリゴヌクレオチドデンドリマーは、新開発の2分枝または3分枝ホスホアミダイド シントンを使って合成する事ができます。^1,2　デンドリマーの利点としては、次のような所があります。　_g-³²P-ATPとポリヌクレオチドキナーゼを用いた標識の取り込み量は5’末端の数に比例して増加します。　蛍光性シグナルについても、標識と分枝末端の間にスペーサーを組み込めば、5’末端の数に比例して増強します。　PCRプライマーとしてオリゴヌクレオチドデンドリマーを使用した場合、デンドリマーを持った鎖はT7遺伝子6エクソヌクレアーゼによる分解に耐性があるので、PCR二重鎖産物から、複数の標識をつけた1本鎖プローブへ変換することが容易になります。　異世代のDNAデンドリマーについて、溶液中で相補的なペア同士で再会合、あるいは固相サポート上の相補オリゴヌクレオチドのアレイに再会合させるような場合、2重鎖安定性は、同じ長さの枝分かれしていない分子よりも大きい。　DNAデンドリマーの安定性が高まると、ナノ凝集における ’ボトムアップ’ 方式ためのビルディングブロックとしてとても有用になります。この特性は、例えば目的分子の二次構造の融解など、高温が必要とされるDNAチップ技術への適用を示唆しています。

分枝用ホスホアミダイド

分枝用モノマーは、櫛の歯状のオリゴヌクレオチドプローブを作成するのに必要となります。　コームシステムを開発したカイロン社(Chiron Corporation)の開発者チームは、分枝部分を保護する置換基について検討した結果、ヒドラジン水和物、酢酸とピリジンを含む試薬で切り離しができるレブリニル(LEV)基が適当であると選択しています。

光切断モノマー

PCビオチンホスホアミダイドは、5’-ビオチン化オリゴヌクレオチドの合成時に使用し、通常良く利用されている弊社の5’ビオチンホスホアミダイドと同じ要領で、ストレプトアビジンを用いた捕捉に利用できます。　アミノ修飾とチオール修飾オリゴヌクレオチドは、様々なハプテンや蛍光物質との連結だけでなく、オリゴヌクレオチドを多様なビーズや固相表面に固定させるのにとても有用である事が分かっています。　PCアミノ修飾ホスホアミダイドは、光による切出しが可能な5’-アミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成するのに使用します。　PCスペーサーホスホアミダイドは、他の修飾用ホスホアミダイド試薬で追加される修飾基とオリゴヌクレオチドの末端とを繋ぐリンカーとして使用します。　光によって切断されると、DNAに5’-リン酸エステルが生じ、それを遺伝子作成やライゲーション後のクローニングなど、さらなる生物学的な形質転換に適します。

用途が広い光切断DNAビルディングブロックを光誘発ハイブリダイゼーションへ利用した事について、光ミズーリ州ワシントン大学の研究チームが発表しています。¹　in vitroで生体内分子反応を触媒する新しい分子の模索のために用いる、多機能のDNA- RNAコンジュゲートの設計に、この試薬も使用されました。²　ドイツのブルカー・ダルトニクス社(Bruker Daltonik)の研究者チームはさらに、MALDI-TOF質量分析による一塩基多型(SNP)の遺伝子型解析法の1つである"genoSNIP"を開発しています。³　この方法では、光切断リンカーを組み入れることでプライマーエクステンション産物のサイズを縮小する手法を用いており、この光誘発性の鎖はプライマーの3’末端付近で切断されます。　このPCリンカーは、標準的な自動DNA合成機のプロトコールを使ってオリゴヌクレオチド配列内のどの位置にも導入できるようになっています。　PCリンカーホスホアミダイドは、光切断の結果、オリゴヌクレオチド断片の各3’末端および5’末端のそれぞれにモノリン酸エステルを持つ断片となる利点も持っています。

オリゴヌクレオチド-ペプチド・コンジュゲート

近年、DNA-ペプチドコンジュゲートは、分子生物学分野における強力な武器であると言う認識が高まって来ています。 特に、それらは、オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を促進するキャリアとしての能力を持ったペプチドが同定されたことによりますます重要になりました。 しかし、従来よりDNA- ペプチド・コンジュゲートの合成は、扱いにくく、適切な方法がなかったため、それが細胞膜の透過に有効な配列や構造に関する一貫した研究の妨げになっていました。　単一サポートによる統合段階型固相合成法では、化学合成法を組合せる事で、両立が不可能であったペプチドとオリゴヌクレオチドの保護基の問題を解決しました。 更に合成後のコンジュゲーションの適応が可能となり、その選択の幅が広がって来ています。 このような流れの中で、オリゴヌクレオチドとペプチドとのコンジュゲーション用OPeC™試薬を新しく御紹介する事となりました。これらの試薬は、リンクテクノロジー社(Link Technologies Ltd.)のステチェンコとゲイト^1,2によって開発され、この度、弊社より自信をもってお届けできる事となりました。

OPeC™コンジュゲーション法は、ペプチド部分とオリゴヌクレオチド部分をそれぞれのサポートを使った従来の合成法で、簡単に合成する事が出来ます。 それぞれの合成生化学分子は、全ての脱保護後、サポートからの切出しをすると、反応性をもつ官能基が現れるように設計されています。 そしてこの生成物は水性/有機溶媒溶液中において、遊離した官能基が選択的に反応してコンジュゲートされるようになっています。 このOPeC™法は、チオエステル基のペプチドN末が、オリゴヌクレオチドの5’システイニル基と"自然連結反応"を起こす事を利用しています。 ここでは、標準Fmoc-固相ペプチド合成の最後のカップリング段階で、ペン タフロロ-フェニル S-ベンジルチオコハク酸エステルとペプチド修飾試薬(PMR)を使用します。 トリフロロ酢酸による脱保護を行うと、N末がS-ベンジルチオコハク酸で置換されたペプチドが溶液中に生成してきます。 一方、ホスホアミダイドを使った標準固相オリゴヌクレオチド合成の後、O-トランス-4-(N-a-Fmoc-S-3級-ブチルスルフェニル-l-システイニル)アミノ-シクロヘキシル O2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホアミダイドとオリゴヌクレオチド修飾試薬(OMR)を使ってカップリングを行います。 その後アンモニア水溶液で脱保護を行うと、5’-S-3級ブチルスルフェニル-L-システイニル基を持つオリゴヌクレオチドが溶液中に得られます。

末端にチオベンジル基を持つペプチドはチオフェノールを使うとチオフェニル類似体に変換され、同時に修飾オリゴヌクレオチドが消費するトリス(カルボキシエチル)フォスフィンの量が減少します。 これら2つの中間体に対するカップリングを行うと、その後、"自然連結反応"が起こり、オリゴヌクレオチド-ペプチド・コンジュゲートが形成されます。