干渉マッピング

ヌクレオチド類似物干渉マッピング法(NAIM)は、化学的遺伝研究に使用されており、また、1度の実験でRNA核酸の各部位における官能基の特異的な作用を個々に検査できる優れた検査方法です。¹　この試験法では、RNA配列決定操作と同様に修飾障害が起こる過程で、一連の5’-O-(1-チオ)ヌクレオシド類似物3リン酸エステルを使用します。　NAIM実験では、変異の発生原因となる最小部位は塩基対ではなく、核酸を構成する個々の官能基になります。　RNAにおける特定の官能基に生じる修飾反応や欠損反応は、その官能基の反応性に大きく依存するので、この手法は、RNAの構造や機能に関する化学的特徴を同定するのにとても効果的だと言えるのです。

特定部位で化学的に置換を施して一連のRNAを合成しなくとも、NAIMを組み合わせる方法で代用する事ができます。　各核酸類似物は、DNAテンプレートから試験管内転写を行い、RNAへ導入するため、三リン酸エステルの形で合成されます。　この核酸類似物は、塩基、糖及びα-ホスホロチオエートの化学標識がそれぞれ転換しますが、このような特有の化学的性質も含めてNAIMに利用されます。　核酸類似体の三リン酸エステルは、RNA転写の際に無作為に導入され、ヨード(I₂ )を加える事によってホスホロチオエートリンクを選択的に切出す事ができます。　この時得られる切出し済みRNAの長さは類似体が導入された部位によって決定されます² 放射活性を持つか又は蛍光性の標識をこの転写RNAの一端に結合させ、切出した生成物の溶液を変性ポリアクリルゲルで流す事によって、このRNA全体について導入された各類似体の部位を検査し干渉性に分析に使用することができます。 ホスホロチオエート標識核酸類似物は、RNAのどの部分にでも導入することが可能で、一回の分析実験において各修飾基の作用について検査することができます。

ホスホロチオエート標識は、化学的にヌクレオチド類似物から独立しているので、NAIMではRNAポリメラーゼで翻訳時に導入されれば、どんな類似物であっても一般化して分析が可能になります。　最も汎用されているNAIM実験の手法は、4つの段階に分けることができます。

1. ホスホロチオエート標識されたヌクレオチド類似体が、無作為にRNA内へ組み込まれ、2-3の置換基を含んだまま転写が開始されます。　各類似体に対してそれぞれ異なる転写反応が発生します。
2. このような変異型機能性RNAが、不活性転写産物から分離されます。　親和性クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、フィルター結合、放射性標識による選別等、活性分析によって特性を詳細に精査することで、RNAの特性を調べることに繋がります。
3. 活性状態のホスホロチオエートリンクと1本鎖RNAは、ヨード(I₂ )を加えると切出しが起こるので、各核酸分子中に組み込まれた類似物質の位置を明確にする事ができます。
4. 個々のRNA切片まとめてを溶液にしてゲル電気泳動を行い、オートラジオグラフィーで視覚化します。

アデノシン(A)類似物

NAIMで使用するα-ホスホロチオエート標識ヌクレオチド類似物には、それぞれが塩基やリボース糖の化学的に類似構造を持っています。　アデノシン類似物製品は、8つの異なる類似物がそろっており、NAIMへの使用に完全に対応できるよう開発されています。³　この類似物製品の5つは核酸塩基の修飾に使用し、3つはリボース糖の修飾に使用します。　この塩基類似物には、プリンリボシド(PurαS)、N6-メチルアデノシン(m6AαS)、ツベルシジン(7dAαS)、ジアミノプリンリボシド(DAPαS)および2-アミノプリンリボシド(2APαS)が含まれます。　2'-デオキシアデノシン(dAαS)、2'-デオキシ-2'-フロロアデノシン(FAαS)および2'-メトキシアデノシン (OMeAαS)を含むリボース糖類似物は全て、2'-水酸基修飾が施されています。　全ての類似物は、野生型T7 RNAポリメラーゼ又はY639F RNAポリメラーゼによる点突然変異の発生を使用すれば、RNA転写物に5%程度の導入率でランダムにかつ理想的に取り込むことができます。⁴　これらの類似物は、転写配列へ導入される位置に従って、それぞれの特異なRNA化学的活性を示します。

α-チオ3リン酸エステルは、pH7のTE緩衝液(10X濃度)中でナトリウム塩として存在しています。　この濃度は、ポリメラーゼ反応時における結合に最適な濃度です。

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