突然変異誘発用オリゴヌクレオチド合成試薬 |
トリマー(3量体)ホスホアミダイド
理論上、最も単純なオリゴヌクレオチド誘発型突然変異(oligonucleotide-directed mutagenesis)の手順としては、トリマーホスホアミダイドを使用する方法があります。 組み合わせが可能となる64種のコドンの内、20種のアミノ酸を表記するためには20個のコドンが必要となります。 しかし実際には、生物によっていくつかのコドンが重複している事があります。 弊社の3量体は、カユシン他の研究チームより発表されている防護機構を使用しております。1-3 各3量体の配列が特定されているかどうか検証する必要があります。 例えば、"CAT"はヒスチジンを表しており、チロシンを表す"TAC"と区別されなければなりません。 しかし、これら2つの3量体は化学物質として実質的には同一の親油性を持っているため、HPLCではそれぞれを明確に区別する事ができません。 この問題を解決するためには、この3量体について、HPLC電子スプレー式質量分析を行い、以下に記載している分子量及び配列の標準データと照らし合わせる必要があります。4
以下の表1は、3量体が表しているアミノ酸とその反応係数(RF)が記載されています。 3量体は大抵混合して使用する事が多く、カップリング反応時の反応性がそれぞれ異なるため、この反応係数がとても重要になります。 核酸塩基の組み合わせが"AAC"の時の反応係数(RF)は、1.0で、"TAC"の場合は1.6になります。 従って、係数1.6の"TAC"に対応するカップリング等量を考える際、係数1.0で等量になる"AAC"が必要となります。 混合体は等モル濃度の溶液から簡単に作る事ができます。 又は適切な重量の各トリマーを合成し、重量に応じて適正な量を混合する事によって作成できます。 例えば、全20種類のトリマー混合品を調整するには、表1のRF調整mg/10µmol量に表示した量で調整し、全量として最後の欄外の量とします。
現在では全種類のトリマーが単体としてご提供しておりますので、ご自身でご希望の混合体を作成する事ができます。 20種全てについて同等のカップリングが可能になるようデザインされた全20種のトリマーミックスもご用意しております。 特殊な混合品をご希望の際は、お気軽にメールでお問合せ下さい。 ntsshiyaku@aol.com
表1: トリマーコドンとその物理特性
| トリマー | アミノ酸 | 1字表記 | MW | RF | MWxRF | mg/10µmol (RF調整値) |
| AAA | Lys | K | 1911.5 | 1.1 | 2102.65 | 21.0 (11) |
| AAC | Asn | N | 1887.5 | 1.0 | 1887.50 | 18.9 (10) |
| ACT | Thr | T | 1774.5 | 1.3 | 2306.85 | 23.1 (13) |
| ATC | Ile | I | 1774.5 | 1.2 | 2129.40 | 21.3 (12) |
| ATG | Met | M | 1780.5 | 1.3 | 2314.65 | 23.1 (13) |
| CAG | Gln | Q | 1869.5 | 2.0 | 3739.00 | 37.4 (20) |
| CAT | His | H | 1774.5 | 1.9 | 3371.55 | 33.7 (19) |
| CCG | Pro | P | 1845.5 | 1.8 | 3321.90 | 33.2 (18) |
| CGT | Arg | R | 1756.5 | 1.1 | 1932.15 | 19.3 (11) |
| CTG | Leu | L | 1756.5 | 1.2 | 2107.80 | 21.1 (12) |
| GAA | Glu | E | 1893.5 | 1.9 | 3597.65 | 36.0 (19) |
| GAC | Asp | D | 1869.5 | 1.3 | 2430.35 | 24.3 (13) |
| GCT | Ala | A | 1756.5 | 1.5 | 2634.75 | 26.3 (15) |
| GGT | Gly | G | 1762.5 | 1.1 | 1938.75 | 19.4 (11) |
| GTT | Val | V | 1667.5 | 1.9 | 3168.25 | 31.7 (19) |
| TAC | Tyr | Y | 1774.5 | 1.6 | 2839.20 | 28.4 (16) |
| TCT | Ser | S | 1661.4 | 1.3 | 2159.82 | 21.6 (13) |
| TGC | Cys | C | 1756.5 | 1.5 | 2634.75 | 26.3 (15) |
| TGG | Trp | W | 1762.5 | 2.4 | 4230.00 | 42.3 (24) |
| TTC | Phe | F | 1661.4 | 1.3 | 2159.82 | 21.6 (13) |
| =530.0 mg | ||||||
トリマーミックスの調整方法(例)
530mgのトリマーミックスを用意するには、各トリマーについて、上記の表のRF調整値欄に記載されている量(mg)をそれぞれ取って混合します。 このトリマーミックスは、ジクロロメタン(できる限り最高等級品を使用：無酸性)に溶解させます。 最後に揮発性物質を蒸発させて乾燥すれば、20種の3量体の均一混合物が完成します。
合成機で使用する際の3量体調整方法
530mg（RF値で調整した20ｘ10µmolesのトリマーミックスと同等量）を2.0mL のアセトニトリル-ジクロロメタン(1:3v/v)混合液に溶解すると、0.10N 3量体溶液ができます。この溶液はそのまま合成機への使用が可能です。
参考文献
(1) A.L. Kayushin, M.D. Korosteleva, A.I. Miroshnikov, W. Kosch, D. Zubov, and N. Piel, Nucleic Acids Research, 1996, 24, 3748-3755.
(2) A. Kayushin, et al., Nucleos Nucleot, 1999, 18, 1531-1533.
(3) A. Kayushin, M. Korosteleva, and A. Miroshnikov, Nucleos Nucleot Nucleic Acids, 2000, 19, 1967-1976.
(4) T. Mauriala, S. Auriola, A. Azhayev, A. Kayushin, M. Korosteleva, and A. Miroshnikov, J Pharm Biomed Anal, 2004, 34, 199-206.
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B=Abz, Cbz, Gibu, Tにおける |
| 商品 | 商品番号 | 内容 | 価格($US) |
| AAA トリマーホスホアミダイド | 13-1000-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1000-90 | 100µm | 700.00 | |
| AAC トリマーホスホアミダイド | 13-1001-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1001-90 | 100µm | 700.00 | |
| ACT トリマーホスホアミダイド | 13-1013-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1013-90 | 100µm | 700.00 | |
| ATC トリマーホスホアミダイド | 13-1031-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1031-90 | 100µm | 700.00 | |
| ATG トリマーホスホアミダイド | 13-1032-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1032-90 | 100µm | 700.00 | |
| CAG トリマーホスホアミダイド | 13-1102-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1102-90 | 100µm | 700.00 | |
| CAT トリマーホスホアミダイド | 13-1103-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1103-90 | 100µm | 700.00 | |
| CCG トリマーホスホアミダイド | 13-1112-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1112-90 | 100µm | 700.00 | |
| CGT トリマーホスホアミダイド | 13-1123-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1123-90 | 100µm | 700.00 | |
| CTG トリマーホスホアミダイド | 13-1132-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1132-90 | 100µm | 700.00 | |
| GAA トリマーホスホアミダイド | 13-1200-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1200-90 | 100µm | 700.00 | |
| GAC トリマーホスホアミダイド | 13-1201-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1201-90 | 100µm | 700.00 | |
| GCT トリマーホスホアミダイド | 13-1213-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1213-90 | 100µm | 700.00 | |
| GGTトリマーホスホアミダイド | 13-1223-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1223-90 | 100µm | 700.00 | |
| GTT トリマーホスホアミダイド | 13-1233-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1233-90 | 100µm | 700.00 | |
| TACトリマーホスホアミダイド | 13-1301-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1301-90 | 100µm | 700.00 | |
| TCTトリマーホスホアミダイド | 13-1313-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1313-90 | 100µm | 700.00 | |
| TGC トリマーホスホアミダイド | 13-1321-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1321-90 | 100µm | 700.00 | |
| TGG トリマーホスホアミダイド | 13-1322-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1322-90 | 100µm | 700.00 | |
| TTC トリマーホスホアミダイド | 13-1331-95 | 50µm | 350.00 |
| 13-1331-90 | 100µm | 700.00 | |
| トリマーホスホアミダイドミックスNo.1 | 13-1991-95 | 50µm | 515.00 |
| (上記トリマー20種の混合物) | 13-1991-90 | 100µm | 1030.00 |
| トリマーホスホアミダイドミックスNo.2 | 13-1992-95 | 50µm | 515.00 |
| (TGC(Cys)を除くトリマー19種の混合物) | 13-1992-90 | 100µm | 1030.00 |
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ATC トリマー |